去外泌體胎牛血清富含多種營養,滿足細胞粘附、生長、增殖、解毒等需求?蔀榕R床治療骨破壞提供新思路。同時,國外的研究表明,使用祛除外泌體的胎牛血清培養細胞,大多數細胞的生長速率均降低,提示血清中的外泌體在細胞生長及存活方面起到一定的作用。
去外泌體胎牛血清超濾法提取步驟:
超濾法適用于細胞上清的提取,一般需要200ml培養基,適用于純化大量外泌體。常見的過濾膜有孔徑0.8微米,0.45微米或0.22微米,可用于收集大于800納米,400納米或200納米的外泌體。超濾離心法簡單高效,且不影響外泌體的生物活性。
。1)低速離心以除去細胞成分,500g離心10min。收集上清。
。2)使用0.22微米過濾器過濾細胞碎片以及大囊泡。收集濾液。
。3)將濾液轉移至裝有超濾膜的超濾儀,氮氣加壓過濾。收集濾液。
。4)將過濾后懸液轉移至離心管,100000 g離心40min。收集沉淀。
。5)外泌體重懸于適量培養基中。使用0.22微米過濾器過濾,分裝外泌體懸液,-80度保存,避免反復凍融。
外泌體(exosomes)是活細胞分泌的直徑約為30-150nm的膜性囊泡,準確來講,外泌體是一類由細胞釋放的細胞外囊泡。廣泛存在于多種體液中,包括血液、唾液、尿液和母乳。根據其生物合成或釋放途徑可以對細胞外囊泡進行分類:
1.外泌體(exosomes):起源于內吞途徑,直徑為30-150nm,其密度約為1.11-1.19g mL-1;
2.微粒/微囊泡(microparticles):直接從質膜釋放,直徑約100-1000nm;
3.凋亡小體(apoptoticbody/bleb):由細胞凋亡產生,直徑約為50nm-2um;
4.腫瘤小泡(large oncosomes):由腫瘤細胞釋放產生,直徑約1-10um;
5.以及其他各種EV亞群。